BAB 1

PENDAHULUAN

1.1.   Latar Belakang

             Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Dwidjoseputro,2003).

                Bakteri merupakan mikrobia prokariotik uniselular, termasuk kelas Schizomycetes, berkembang biak secara aseksual dengan pembelahan sel. Bakteri tidak berklorofil kecuali beberapa yang bersifat fotosintetik. Cara hidup bakteri ada yang dapat hidup bebas, parasitik, saprofitik, patogen pada manusia, hewan dan tumbuhan. Habitatnya tersebar luas di alam, dalam tanah, atmosfer (sampai 10 km diatas bumi), di dalam lumpur, dan di laut. Bakteri mempunyai bentuk dasar bulat, batang, dan lengkung. Umumnya bakteri berukuran 0,5-10 µm. Para ahli menggolongkan struktur bakteri menjadi dinding luar, sitoplasma, dan bahan inti. Bakteri memiliki flagel atau bulu cambuk, pili atau fimbriae, kapsula atau lapisan lendir, dinding sel dimana ada yang struktur dinding sel bakteri Gram Negatif yaitu merupakan struktur yang berlapis, sedangkan bakteri Gram Positif mempunyai satu lapis yang tebal. Dalam sel baktri terdapat membran sitoplasma, protoplasma, inti, organel-organel lain yang memiliki peran masing-masing. Bila bakteri tumbuh di dalam medium yang tidak cair, maka terjadilah suatu kelompok yang dinamakan koloni. Bentuk koloni berbeda-beda untuk setiap spesies, dan bentuk itu merupakan ciri khas bagi suatu spesies tertentu. Pengamatan bakteri dapat kita lakukan secara individual, satu persatu, maupun secara kelompok dalam bentuk koloni, dan sifat-sifatnya dapat kita ketahui melalui koloni yang tumbuh di medium permukaannya (Emila, 2005).

1.2.  Tujuan

          Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengenal bentuk pertumbuhan koloni dan sifat-sifat karakteristik koloni bakteri pada berbagai bentuk media, mengetahui cara mewarnai bakteri, mempermudah melihat bentuk jasad mikrobia, memperjelas ukuran dan bentuk mikrobia.

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1.  Pewarnaan Gram

Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan  fisik dinding sel mereka. Metode tersebut diberi nama berdasarka penemunya ilmuwan Denmark, Hans Christian Gram (1853-1938) yang mengembangkan teknik tersebut pada tahun 1884 untuk membedakan antara Pneumococcus dan bakteri Klebsiella pneumonia (Dwidjoseputro, 2003).

Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram. Bakteri jenis tersebut akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negatif akan berwarna merah muda atau merah. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri tersebut terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Waluyo, 2007).

Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau Kristal ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian tersebut berguna untuk mengklasifikasikan  kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Dwidjoseputro, 2003).

Metode pewarnaan spora berfungsi untuk mempermudah pengamatan agar peneliti atau pengamat mampu melihat spora, membedakan dengan sel vegetative ataupun mengamati bentuknya. Endospora tidak mudah diwarnai dengan zat pewarna pada umumnya. Hal tersebut yang menjadi dasar dari metode pengecatan endospora dengan larutan hijau malasit. Metode Shaeffor, foton endospora diwarnai pertama dengan larutan hijau malasit. Pengecatan tersebut sifatnya kuat karena dapat berpenetrasi ke dalam endospora dengan perlakuan larutan hijau malasit. Teknik tersebut akan menghasilkan warna hijau pada endospora dan merah pada sel vegetative (James, 2002).

Faktor–faktor  yang  perlu  diperhatikan  dalam  melakukan  isolasi  mikroba  antara lain sifat jenis  mikroba  yang  akan diisolasi, tempat  hidup atau asal mikroba tersebut, medium untuk pertumbuhannya yang sesuai, cara inkubasi mikrobia, cara menanam mikroba tersebut, cara menguji bahwa mikrobia yang diisolasi telah berupa biakan murni dan sesuai dengan yang dimaksud, cara memelihara agar mikrobia yang telah diisolasi tetap merupakan biakan murni Cara–cara untuk mengisolasi khamir yaitu dengan cara Hansen dengan menggunakan ruangan lembab (moist chamber method of Hansen), cara pengenceran (dilution method), cara Linder (the Linder method), dan dengan metode micromanipulator (Suryanto, 2006).

Cara pengecatan bakteri umumnya menggunakan lebih dari satu tingkat pengecatan dimana hasil pengecatan sangat dipengaruhi oleh beberapa paktor seperti fiksasi, substrat, dan cat peluntur. Sebelum bakteri dicat harus dilakukan fiksasi terlebih dahulu, cara yang paling banyak dilakukan ialah cara fisik (Nur Indriyani, 2007).

2.2.  Macam Pewarnaan Gram

Pewarnaan pada bakteri dibagi menjadi tiga, yaitu :

2.2.1. Pewarnaan sederhana

            Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan. Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan (Karmana, 2008)

a. pewarnaan asam

          Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan positif adalah metilen biru dan air furksin (James, 2002).

b. Pewarnaan Basa

           Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina ( Suryanto, 2006)

2.2.2.       Pewarnaan Diferensial (Gram)

              Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Suriawiria, 2005).

a.  Bakteri Gram Negatif

               Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara bakteri gram negative tidak (Suryati, 2006).

b.  Bakteri Gram Positif

               Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Waluyo, 2007)

           Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek (Nur, 2007).

2.3. Perbedaan Gram Positif dan Negatif

Ada beberapa perbedaan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Menyatakan bahwa gram positif dinding selnya mengandung peptidoglikan dan juga asam teikoat dan asam teikuronat. Oleh sebab itu dinding sel bakteri gram positif sebagian adalah polisakarida. Pada beberapa bakteri asam teikoat merupakan antigen permukaan (antigen dinding sel), dan ada yang merupakan selaput pada selnya. Asam teikoat ini pada umumnya terdiri dari gula netral seperti galaktosa, manosa, ramnosa, arabinosa dan glukosamin. Lapisan yang demikian itu akan menyelimuti seluruh sel bakteri sehingga menyerupai selubung yang kuat dan dinamakan murein

 (Karmana, 2008).

Sedangkan pada dinding sel bakteri gram negatif terdapat peptidoglikan yang sedikit sekali dan berada diantara selaput luar dan selaput dalam dinding sel. Dinding sel bakteri gram negatif sebelah luar merupakan komponen yang terdiri dari fosfolipid dan beberapa protein yang sering disebut sebagai auto layer (James, 2002).

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat	Bakteri garam (+)	Bakteri gram negatif(-)
Komposisi dinding sel	Kandungan lipid rendah (1-4%)	Kandungan lipid tinggi
Ketahanan terhadap penisilin	Lebih sensitif	Lebih tahan
Penghambatan oleh pewarna basa (VK)	Lebih dihambat	Kurang dihambat
Kebutuhan nutrisi	Kebanyakan spesies relatif kompleks	Relatif sederhana
Ketahanaa terhadap perlakuan fisik	Lebih tahan	Kurang tahan

2.4.Pewarnaan Khusus

                Pewarnaan khusus merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai struktur khusus atau tertentu dari bakteri seperti bagian spora, kapsul, flagel dsb. Contoh pewarnaan khusus :Pewarnaan Endospora Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum, dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi, dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas. Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (Emila, 2005).

a.  Pewarnaan kapsul

            Pewarnaan ini menggunakan larutan kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap (Waluyo, 2007).

b.  Pewarnaan spora

            Dinding spora relatif tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara memanaskan preparat.

c.  Pewarnaan flagel

Pewarnaan flagel dengan memberi suspensi koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d.  Pewarnaan nucleoid

Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA 

BAB 3

PELAKSANAAN PRAKTIKUM

3.1.   Waktu dan Tempat

Praktikum dasar-dasar mikrobiologi Akuatik tentang pewarnaan Gram dilaksanakan pada hari Selasa, 10 Maret 2015 pukul 14.20 WIB sampai dengan selesai, di Ruang Seminar program studi Akuakultur, Fakultas Pertanian, Universitas Sriwijaya.

3.2.   Alat, Bahan dan Metoda

3.2.1.  Alat

Alat yang digunakan dalam praktikum ini dapat dilihat pada tabel 3.2.1.

Tabel 3.2.1. Alat yang digunakan dalam pewarnaan Gram

No.	Nama Alat	Spesifikasi	Fungsi
1.	Bunsen	2	Untuk mengeringkan sampel yang akan diamati
2.	Erlenmeyer	2	Sebagai wadah larutan
3.	Jarum ose	1	Untuk mengambil sampel
4.	Mikroskop	1	Untuk mengamati sampel
5.	Pipet tetes	1	Untuk mengambil larutan
6.	Preparat	1	Sebaagai tempat pewarnaan gram

3.2.2.  Bahan

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini dapat dilihat pada tabel 3.2.2.

Tabel 3.2.2. Bahan yang digunakan dalam pewarnaan Gram

No.	Nama Bahan	Spesifikasi	Fungsi
1.	Aquadest	Secukupnya	Untuk mencuci kaca objek
2.	Pewarna A (Crystal violet)	Secukupnya	Pewarna 1
3.	Pewarna B (Lugols iodine)	Secukupnya	Pewarna 2
4.	Pewarna C (Alkohol 96%)	Secukupnya	Pewarna 3
5.	Pewarna D (Safranin)	Secukupnya	Pewarna 4

3.2.3.  Metoda

Metoda yang digunakan dalam praktikum pewarnaan Gram adalah sebagai berikut:

Letakkan bakteri pada kaca preparat

 

Teteskan kristal violet (2-3 tetes) Diamkan 1 menit

 

Bilas dengan aquadest

 

Teteskan lugol iodin

 

Bilas dengan aquadest

 

Teteskan alkohol 96%

 

Teteskan safranin

 

Amati dengan mikroskop

BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1.  Hasil

            Adapun hasil dari praktikum pewarnaan gram adalah sebagai berikut:

1.  Objek                                  : Bakteri

2.  Warna yang dihasilkan       : Ungu (positif)

        

                    

    

 

4.2.  Pembahasan

Pada praktikum kali ini yaitu percobaan pewarnaan gram, proses pertama yang perlu dilakukan yaitu proses fiksasi yang merupakan proses mematikan bakteri yang tidak diinginkan secara cepat. Proses ini awalnya dilakukan dengan membakar kaca objek yang akan diletakkan dengan mikroba atau bakteri. Lalu kaca objek tersebut ditetesi dengan bakteri yang akan diamati. Setelah itu dibakar lagi untuk membunuh bakteri-bakteri yang tidak diinginkan.

Pewarnaan gram dibagi menjadi dua hasil yaitu gram positif dan gram negative, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta safranin atau kristal violet. Contoh dari bakteri gram positif ialah Clostridium perfringens, Staphylococcus aureas, sedangkan bakteri gram negative misalnya adalah Eschericia Coli. Beberapa bakteri tidak terwarnai dengan pewarnaan gram, misalnya Mycobacterium spp, karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasinya. Pada pewarnaan tersebut sel bakteri akan berwarna merah tetapi sel jaringan akan berwarna hijau (James, 2002).

Hasil pewarnaan pada bakteri gram, bila pada bakteri gram positif akan berwarna ungu violet dan pada pewarnaan gram negative akan berwarna merah. Pada percobaan kali ini hasil yang diperoleh adalah warna ungu kebiru-biruan, itu berarti menandakan bahwa bakteri yang dihasilkan adalah bakteri gram positif. Faktor-faktor yang mempengaruhi dalam pewarnaan mikrobia antara lain fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarna untuk mempercepat pewarnaan mikrobia sehingga zat akan terikat lebih mudah di dalam jaringan.

      Tujuan dari pewarnaan bakteri yaitu untuk mempermudah melihat bentuk jasad mikroba, memperjelas ukuran dan bentuk jasad mikroba, memungkinkan untuk pengamatan struktur luar dan dalam jasad mikroba dan melihat reaksi jasad terhadap pewarnaan yang diberikan. Berdasarkan tujuan dari pewarnaan bakteri tersebut, dalam praktikum praktikan telah membuktikannya dengan hasilyang didapat, bakteri dengan warna ungu dan warna merah bata. Warna tersebut sangat membantu unutuk mengidentifikasi bakteri tersebut.

BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1.  Kesimpulan

            Kesimpulan yang diperoleh dari praktikum pewarnaan Gram adalah sebagai berikut:

1.      Bakteri Staphylococcus adalah bakteri yang termasuk dalam bakteri gram positif yang berwarna ungu.

2.      Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yaitu gram positif dan gram negative, berdasarkan sifat kimia dan  fisik dinding sel mereka.

3.      Dengan pewarnaan Gram mempermudah untuk mengidentifikasi jenis bakteri.

4.      Bakteri garam positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu atau kristal ungu sewaktu proses pewarnaan gram.

5.      Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram.

B.   Saran

         Dalam praktikum sebaiknya kita menggunakan beberapa jenis bakteri seperti bakteri yang memiliki sifat yang variabel jadi kita dapat membedakan warna dengan mudah.